血管性痴呆是由脑梗塞、脑出血等病理过程引起，它在老年痴呆中占有重要地位，文献资料表明，老年痴呆中大约12％－20％是多发梗塞性痴呆，同时合并Alzheimer病的占病人的16％－20％（1，2）。由于高度依赖于有氧代谢提供能量，并且神经细胞需氧量很高，神经细胞极易受到缺血缺氧损伤。脑缺血缺氧可导致脑神经细胞的功能和结构的破坏，从而引起各种脑部疾病的发生。因此防止脑缺血缺氧损伤在预防老年痴呆中具有重要意义。NaCN加缺糖和连二亚硫酸钠加缺糖引起的神经细胞和PC12细胞缺血缺氧损伤模型是筛选神经元损伤保护作用药物的常用模型（3，4，5，6），适合于研究药物对缺血缺氧损伤的保护作用。因此本实验采用中药血清药理学方法，以NaCN加缺糖和连二亚硫酸钠加缺糖引起的PC12细胞缺血缺氧损伤为模型，研究了脑力智宝提取物及含药血清请对PC12细胞缺血所缺氧损伤的保护作用，并就脑力智宝给药次数、采血时间、反应体系血清加入量等中药血清药理学方法学进行了探讨。

材料和方法
一． 动物 昆明种小鼠，雌雄各半，体重22±3g，是中国药科大学实验动物中心提供。
二． 药品和试剂
结果
一．不同浓度的药物血清对PC12细胞缺血性损伤的影响 结果表明，2.5％的脑力智宝含药血清对细胞具有明显的保护作用。而加入10％或以上的鼠血清，无论正常血清还是含药血清均表现出明显的细胞保护作用，出现假阳性结果，这可能由于血清本身的复杂成分所致。结果见Tab.1.1。
二．不同的给药次数、采血时间的含药血清对PC12细胞缺血损伤的影响 结果表明，单次给药0.5h、1h、2h、3h的含药血清虽具有一定的细胞保护作用，但统计学上未见有显著性差异（P＞0.05）。二次给药后1h、2h的含药血清具有明显的保护作用，统计学结果具有明显的差异。而七次给药后的各时间点所采集的血清均具有明显的细胞保护作用，尤以给药后0.5h、1h的含药血清作用最为明显（P＜0.001）。结果见Tab.1-2。
三．脑力智宝对NaCN致PC12细胞缺血性损伤的影响 PC12细胞暴露在含NaCN不含糖的Earle's缓冲液中，20min后，倒置显微镜观察，可看到细胞突起结构消失，细胞固缩，肿胀，折光率下降，部分细胞出现膜破裂，溶解成碎片。MTT微量比色法和LDH测定结果显示，损伤细胞对MTT摄取能力明显下降，LDH大量释放表明细胞受到了损伤或部分细胞已经死亡。给予脑力智宝提取物和含药血清后，镜下观察细胞突起结构消失现象明显减少，细胞碎片亦明显减少，对MTT摄取能力较不给药组明显增强，0.04mg/ml．0.16mg/ml．0.63mg/ml．2.50mg/ml的脑力智宝提取物对NaCN引起的PC12细胞损伤的抑制率分别为4.7%、44.2%、62.8%和93.0%，3g/kg、6g/kg、12g/kg脑力智宝含药血清对PC12细胞损伤的抑制率分别34.7%，44.2%和62.8%，给药后LDH的漏出明显减少并具有较好的剂量依赖性，2.50mg/ml脑力智宝提取物和12g/kg含药血清的抑制率分别为87.9％和65.1％。结果见Tab.1－3
四．脑力智宝对连二亚硫酸钠致PC12细胞损伤的影响 PC12细胞在2mmol/L的连二亚硫酸钠作用下有明显的损伤，镜下观察可见细胞的突起减少或消失，细胞肿胀变圆，给予脑力智宝提取物及含药血清均能明显对抗缺血缺氧引起的细胞形态学变化，表现为细胞突起结构消失减少，细胞减少。PC12细胞经2mmol/L连二亚硫酸钠处理后对MTT的摄取能力下降，OD值明显低于对照组，表现细胞受到损伤或部分细胞已经死亡，各给药组的脑力智宝提取物及含药血清均能明显提高PC12细胞对MTT摄取能力，OD值明显高于模型组，活细胞明显增多，并具有较好的浓度依赖性。而5×10－6mol/L尼莫地平和16mg/kg的尼莫地平含药血清与模型组比较未见有明显的差异。2mmol/L连二亚硫酸钠可使培养液中的LDH活性明显增加，给予脑力智宝提取物及不同浓度的含药血清均能明显抑制LDH释放，并呈现明显的剂量依赖性。结果见Tab.1-5,1-6。

讨论
中枢神经系统（CNS）神经元依赖氧和糖的供应，在衰老及某些疾病如脑卒中等，血供受阻或能量代谢障碍的情况下，神经元尤为脆弱。与原代培养的神经细胞相比，神经瘤细胞株具有细胞单一，不杂有其它细胞，生长繁殖快，培养周期短，使用方便，更易控制等优点，因此常用作研究神经元损伤和药物作用的体外模型。文献报道PC12细胞株作为体外模型其结果与原代培养神经细胞甚至与在体脑缺血模型一致（3）。PC12细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬组细胞瘤克隆化的细胞株，分化的PC12细胞具有较典型的神经内分泌细胞和特征，它广泛用作研究神经细胞分化、离子通道、受体、递质分泌的实验材料，也是研究神经毒性的最常用的细胞株（3，4）。很多文献报道，氰化物引起神经元损伤的机制与激活NMDA受体有关，氰化物可使内源性Glu大量释放，引发兴奋性毒性作用（12，13，14）。连二亚硫酸钠（Na2S2O4）是氧清除剂，它能清除培养基中的氧，它在短时间内即可造成细胞缺氧损伤，研究表明它可使兴奋性氨基酸NMDA受体活性明显增强（5，6，15）。因此我们采用NaCN和连二亚硫酸钠所致的缺血缺氧损伤模型研究了脑力智宝对神经细胞缺血缺氧损伤的保护作用。
实验表明，给予20mmol/L的NaCN和2mmol/L Na2S2O4可使PC12细胞存活率明显降低，LDH释放明显增加。脑力智宝能明显减轻缺血缺氧造成的PC12细胞损伤，使存活细胞数量增加，LDH释放减少，减轻细胞形态的变化。表明脑力智宝对PC12细胞缺血缺氧损伤具有保护作用。脑力智宝是由多种中药组成的，其中红花所含有的红花甙、新红花甙等甙类对脑缺血性缺氧损伤具有保护作用，临床上用于治疗缺血性脑血管病。当归、首乌和五味子等具有抗自由基的作用，益智仁中的益智醇有钙拮抗作用，可用于缺血性脑中风，脑动脉硬化等脑血管疾病（16），这些中药成分及其代谢产物保护PC12细胞缺血缺氧性损伤，脑力智宝对神经细胞缺血性损伤的保护作用，可能是其治疗脑病的部分作用机理。
结果表明：单次给药后不同时间点的含药血清只有微弱的细胞保护作用，与正常鼠血清无显著性差异。二次给药后1h、2h、3h采集的药物血清，与对照组血清比较具有明显的差异。但七次给药后各时间点所采集的含药血清对NaCN加缺糖所致PC12细胞损伤的保护作用比较稳定，尤以0.5h、1h含药血清作用最为明显。但不论是二次给药还是七次给药，给药后3h的保护作用似有所下降，这可能是中药的某些成分如红花中的红花甙，当归中的阿魏酸，益智仁中的益智醇等在给药后1－2h血药浓度较高且发挥较强的细胞保护作用的结果。从实验的简便出发，二次给药后所采集的含药血清可满足实验的要求。但从临床用药习惯和药代动力学的"平均稳态浓度"概念考虑，中药临床用药一般3－4剂一天两次给药，即可发挥药效，呈现药物的作用，并可达到平均稳态浓度（17）。我们的研究也表明七次给药后药物作用的稳定性较好，并可能反映药物代谢物和药物诱生的机体内源性物质所起的作用。因此一天二次给药连续七次方案是较合量的。
本研究的资料表明，加入10％或以上的空白血清和含药鼠血清均对PC12细胞缺血缺氧损伤具有保护作用，因此加入血清浓度太高，可能造成阳性结果，不利于药效评价，5％药物血清与正常对照组血清比较统计学结果具有明显的差异，表明5％的血清添加量即能建立PC12细胞缺血缺氧损伤模型，又能反映药物的明显的药理作用。20％的药物血清加入量对细胞保护作用却减弱，表明细胞保护作用并不随着给药剂量的增加而成比例的增加。并且血清的本身的细胞毒作用都会影响实验结果。许多研究表明，20％的血清浓度最好（18，19），但吴建宇（20）等研究表明添加15％和20％的血清时，在体外无法造成自由基损伤血管内皮受损模型，10％的血清浓度即能成功的制造血管内皮受损模型，药物血清又有明显的药理效应。因此不同的中药复方，不同的实验模型，含药血清最佳作用浓度也不同。此实验也表明中药复方，不同的实验模型，含药血清最佳作用浓度也不同。此实验也表明中药血清药理学方法在体外实验模型建立方面存在着局限性。