提要　运用血清药理学方法，取新生小鼠大脑皮层进行体外神经细胞培养，建立离体的神经细胞谷氨酸损伤模型，通过形态学观察、MTT自动微量法研究"李氏5号方"对原代培养皮层神经细胞谷氨酸损伤的影响。研究结果表明"李氏5号方"水煎剂(含挥发油成分)虽能抑制原代培养皮层神经细胞损伤，但作用不显著，而"李氏5号方"含药血清则能不同程度地抑制谷氨酸介导的神经损伤，并呈剂量依赖性。提示"李氏5号方"可拮抗兴奋性氨基酸神经毒性。
　　关键词　血清药理学；"李氏5号方"；培养神经细胞；谷氨酸损伤

　　
前文报告了"李氏5号方"对PC12细胞的促增殖和抗损伤作用［1］，本文研究了"李氏5号方"对原代培养皮层神经细胞谷氨酸损伤的影响。

1　材料与方法
1.1　试验药物　"李氏5号方"药粉由李子中教授提供，同前报［1］。
1.2　动物　昆明种小鼠，体重22±3g，雌雄各半，由中国药科大学实验动物场提供。
1.3　药品和试剂　多聚赖氨酸(poly-l-lysine),Sigma产品；小牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所产品；完全DMEM培养基，Gibco产品，1L DMEM培养液中含NaHCO3 3.7g、青霉素G钠100U／ml、链霉素100μg/ml及10%小牛血清，pH7.4；胰蛋白酶，Sigma产品，以D-Hanks液配成0.25%的溶液，NaHCO3调PH7.4，过滤除菌，4℃保存；L-谷氨酸，上海伯奥生物科技公司产品；MTT(溴化-(4，5-二甲-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑)，Fluka产品；尼莫地平，天津市中央制药厂产品；其它试剂均为市售分析纯。
　　D-Hanks液及无糖Earle's液同前报［1］。
1.4　小鼠脑皮层神经细胞的原代培养［2］　取新生1天小鼠放入75%酒精中消毒后，置超净工作台内，移入放有PBS的烧杯中，浸泡片刻，取出置已盛有D-Hanks液平皿内，剪开头部皮肤，剥离大脑皮层迅速置于冰冷的D-Hanks液中，剔除脑膜和血管，皮层组织移至盛有少量D-Hanks液的小瓶中，用眼科剪将组织剪成糜状，加入0.25%的胰蛋白酶盖过组织碎块，37℃消化30min，反复吹打使脑组织分散，加含10%小牛血清的DMEM培养基终止消化，静置，吸出上层细胞悬液于消毒的刻度离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，沉淀加含10%小牛血清的DMEM制成细胞悬液，接种于预先用poly-l-lysine涂布的24孔板中，置37℃5%CO2的培养箱中培养，24h后换液一次，以后每3天换液一次，第7天换成含阿糖胞苷(终浓度为5μg/ml)的培养液以抑制胶质细胞等非神经细胞的增殖，48h后换成正常培养基，挑选细胞密度接近、生长状态一致的培养孔用于实验。
1.5　"李氏5号方"对谷氨酸诱发神经细胞损伤的影响［3～5］　李氏5号方及含药血清的制备见前报［1］。挑选的细胞分为对照组(Ⅰ)、谷氨酸组(Ⅱ)、谷氨酸+尼莫地平组(Ⅲ)、谷氨酸+"李氏5号方"0.1mg/ml组(Ⅳ)、谷氨酸+"李氏5号方"0.5mg/ml组(Ⅴ)、谷氨酸+"李氏5号方"2.5mg/ml组(Ⅵ)、无药血清对照组(Ⅶ)、谷氨酸+无药血清组(Ⅷ)、谷氨酸+尼莫地平血清组(Ⅸ)、谷氨酸+"李氏5号方"3g/kg血清组(Ⅹ)、谷氨酸+"李氏5号方"6g/kg血清组(Ⅺ)、谷氨酸+"李氏5号方"12g/kg血清组(Ⅻ)。
　　吸去原培养液，用无糖Earle's液轻轻荡洗两次，每孔加入无糖Earle's液1ml，作用30min，Ⅲ组加入终浓度为5×10-6mol／L的尼莫地平，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别加入终浓度为0.1mg/ml、0.5mg/ml、2.5mg/ml的"李氏5号方"水煎剂(含挥发油成分)，Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ组分别加入无药血清，尼莫地平组血清，"李氏5号方"3g/kg、6g/kg、12g/kg组血清，并使血清终浓度为5%，作用20min，再加入终浓度为500μmol/L的谷氨酸(Glu)，作用30min；Ⅱ组只加入终浓度为500μmol/L的Glu；Ⅷ组则加入终浓度为5%的无药血清而不加Glu。
　　吸去液体，用D-Hanks液轻轻荡洗两次，每孔加入不含小牛血清的DMEM培养液1ml，37℃，5%CO2培养24h。加入MTT(终浓度为0.5mg/ml)，继续培养4h，吸去培养液，每孔加入200μl 100%的二甲基亚砜，待孔内蓝色颗粒完全溶解后，用酶联免疫检测仪在570nm处测定光密度值(OD)。"李氏5号方"水煎剂(含挥发油成分)及其含药血清对原代培养皮层神经细胞谷氨酸损伤的抑制率的计算方法见前报［1］。

2　结果
2.1　形态学观察　原代培养的皮层神经细胞体饱满，表面光滑呈立体隆起，神经突起形成致密网络。加入Glu产生兴奋性作用后，损伤的神经细胞逐渐退化，胞体肿胀，出现沉积，神经突起断裂，神经元崩解。"李氏5号方"的含药血清预处理后的细胞，能明显对抗Glu引起的形态学改变，表现为减少细胞突起结构的消失，减少细胞碎片的形成。
2..2 MTT自动微量法检测结果　"李氏5号方"水煎液(含挥发油成分)对原代培养皮层神经细胞谷氨酸损伤的影响结果如图1所示，尼莫地平能显著抑制谷氨酸介导的神经损伤(P<0.01)，抑制率为86.3%，但"李氏5号方"水煎液0.1mg/ml、0.5mg/ml和2.5mg/ml对谷氨酸损伤的抑制作用不明显，抑制率分别为3.9%、13.7%、17.6%。
"李氏5号方"含药血清对原代培养皮层神经细胞谷氨酸损伤的影响结果如图2所示，尼莫地平含药血清能显著抑制谷氨酸介导的神经损伤(P<0.01)，抑制率为35.7%，"李氏5号方"3g/kg组血清抑制谷氨酸介导的神经损伤作用不明显，而6g/kg、12g/kg组血清则能显著抑制谷氨酸介导的神经损伤(P<0.05或P<0.01)，抑制率分别为5.4%、26.8%、32.1%。

图1　"李氏5号方"水煎液对原代培养皮层神经细胞谷氨酸损伤的作用(n=4，±s) 与对照组比较** P<0.01；与谷氨酸组比较## P<0.01

图2　"李氏5号方"含药血清对原代培养皮层神经细胞谷氨酸损伤的作用(n=4,±s) 与无药血清对照组比较 ** P<0.01；与无药血清+谷氨酸组比较 # P<0.05, ## P<0.01
3　讨论
　　细胞培养具有周期短，条件易于控制，结果便于观察等特点，是研究中药药理的一种理想方法。但是用中药粗制剂直接加入细胞培养体系中进行实验，在方法上存在很多问题，如中药的杂质成分、各种电解质或鞣质、酸碱度等，都会对细胞的生长造成一定的影响，从而影响实验结果，因此得出的结论并不可靠。而采用血清药理学研究方法，即中药粗制剂经口服吸收后用含药血清进行体外实验，可以排除各种影响因素的干扰，更接近药物体内环境中产生药理效应的真实过程，从而提高了实验结果的可信度。另外，当中药复方含有的有效成分没从胃肠道吸收(如某种高分子化合物)，或经体内吸收代谢后失活，以及本身无直接作用，但经体内代谢后产生作用，或通过刺激第二信使而间接起作用等各种情况，应用这一方法均能很好体现出来［6］。
　　谷氨酸是脑内兴奋性突触的主要神经递质之一，在生理状态下，通过激活NMDA、KA等受体，在学习记忆、神经元的兴奋性突触传递、神经元突触形成及神经回路构建等方面起着重要作用。近年来，大量研究表明，在脑缺氧缺血、脑外伤、癫痫等病理情况下，突触间隙谷氨酸增多，刺激谷氨酸受体异常兴奋可引起神经元变性、坏死，而严重影响神经系统功能［7］。本实验结果表明，"李氏5号方"水煎液(含挥发油成分)对原代培养皮层神经元谷氨酸损伤保护作用不明显，而"李氏5号方"含药血清则能剂量依赖性地抑制谷氨酸对原代培养皮层神经元的损伤，其机制有待进一步研究。

参考文献
1　刘国卿，李　锐，江雪华，等.李氏5号方对神经元的促进增殖和对损伤的保护作用.中药药理与临床，1999；15(2)∶32
2　洪庆涛，唐一鹏.新生大鼠皮层神经细胞的原代培养.神经解剖学杂志，1994；10(3)∶259
3　Goldberg MP,Weiss JH,Pham PC, et al.N-methyl-D-aspartate receptors mediate hypoxic neuronal injury in cortical culture.J Pharmcol Exp Ther，1987；243∶784
4　Lysko PG, Cox JA, Vigano A, et al. Excitatory amino acid neurotoxicity of the N-methyl-D-aspartate receptor
in cultured neurons: pharmacological characterization.Brain Res，1989；499∶258
5　Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunological Methods，1983；65∶55
6　张群豪，钟　蓓，陈可冀，等.用血清药理学方法观察血府逐瘀浓缩丸对实验性动脉粥样硬化家兔主动脉平滑肌细胞增殖的影响.中国中西医结合杂志，1996；16(3)∶156
7　李炜如.兴奋性氨基酸及钙离子内流在缺氧缺血性脑损伤中的作用.中国实用儿科杂志，1997；12(4)∶245