摘要 利用原代培养SD大鼠乳鼠脑皮层神经细胞，从形态学和生化方面研究D－半乳糖和无血清培养对神经元拟老化反应和脑力智宝的抗老化作用。细胞形态学观察，D－半乳糖和无血清培养均可使神经细胞突起脱落回缩，折光率下降。使培养鼠脑皮层神经细胞出现生长发育缓慢，死亡率增高等退行性变，并使鼠脑皮层神经细胞中的SOD含量降低，丙二醛（MDA）水平升高。脂褐素含量增加。给予脑力智宝可明显提高神经细胞损伤后细胞生存率，降低脂褐素和MDA的形成，并显著提高抗氧化酶SOD的活性。结果提示脑力智宝可能通过抑制脂质过氧化产物的生成及提高抗氧化酶的活性来保护拟衰老反应中的脑皮层神经细胞老化的。
关键词 脑力智宝 D－半乳糖 无血清培养 神经细胞 老化
神经细胞老化是老年医学核心问题之一。衰老和脑老化模型是研究衰老和脑老化的表现和机理以及筛选延缓衰老药物的主要手段。蔡琰等（1）首先采用NBA2小鼠神经母细胞瘤细胞无血清培养建立了细胞老化模型，崔旭（2）等用D－半乳糖成功的建立了神经细胞老化模型，并经大鼠和小鼠整体实验表明，D－半乳糖可导致与自然界衰老类似的表现，并证明D－半乳糖引起的衰老机理可能与活性氧自由基过荷有关（3－5）。资料表明，某些生物体内含有半乳糖氧化酶，它在催化D－半乳糖时产生超氧阴离子自由基（O2）和H2O2（6）。
氧化应激参与了神经退行性疾病的发生发展（7，8）。可以推测以超氧自由基为主产生一系列过氧化损伤，可能是引起脑老化的主要原因之一。动物衰老反应很多，其中脑细胞衰老的明显标志为脂褐素（lipofuscin），随着年龄的增加神经元胞体脂褐素的积累明显增加。已研究表明无血清培养，随着时间的延长，培养的神经母细胞瘤细胞脂褐素含量进行性增加（1）。无血清培养大鼠脑皮层神经细胞可引起拟老化反应（9）。因此本实验用原代培养的大鼠乳鼠脑皮层神经细胞，观察了脑力智宝对D－半乳糖和无血清培养两种条件下神经元拟老化反应的影响。并探讨了神经细胞拟老化反应过程中脂褐素的变化及脑力智宝对其影响。 结果
一．脑力智宝对D－半乳糖拟神经细胞老化反应的影响 给予D－半乳糖处理后10天的细胞，在显微镜下可见，神经细胞体变小，突起回缩脱落，数目减少。MTT法测定神经细胞的生存率明显下降，细胞内的SOD活性明显降低，MDA含量明显增高。0.63mg/ml的脑力智宝提取物和3g/kg、6g/kg的脑力智宝含药血清能明显提高细胞的生存率，提高SOD的活性，减少MDA的生成，而5×10-6mol/L的尼莫地平虽然能提高细胞生存率，但对SOD的活性和MDA和含量未见有明显的影响（P＞0.05）。结果见Tab.3-1.3-2
二．脑力智宝提取物及含药血清对无血清培养神经细胞拟老化反应的影响 实验时加入5％的空白对照组血清和含药血清无法造成拟老模型，经实验摸索，2.5％的血清加入量能成功的建立实验模型又能反应药物的作用，因此用2.5％的血清进行实验。
蔡琰等（1985）为建立神经细胞老化实验模型而设计出5种不同成份组成的培养液。结果发现，由胰岛素、白蛋白、DMEM组成的无血清培养液（AID）使NBA2细胞在生长至一定阶段后，分裂处于平衡以至停顿状态，细胞内的脂褐素有进行性积累。因此本实验选用AID这一无血清培养液。
大鼠脑皮层神经细胞培养3－4天时，细胞出现丝状带有分枝的突起，随时间延长细胞体逐渐增大，突起逐渐增长。7天后交织成网状，随着无血清培养时间的延长细胞的突起回缩脱落。神经元类型也发生改变，多极神经元比例减少，低极神经元比例增加，细胞数量减少，细胞死亡率增加，存活细胞突起数目较少，神经细胞内的脂褐素量明显增加（从0.122±0.005到0.346±0.31μg/μg protein）。给予脑力智宝后细胞突起回缩脱落减少，细胞折光率有所增加。神经突起数目较多，形成较密网落。结果可见无论是突起生长还是胞体本身的生长、存活，脑力智宝都有明显的保护作用。细胞计数结果表明在第5天和第10天时细胞数均明显多于对照组，尤以含药血清作用明显，在第15天时更加明显。但无论对照组还是给药细胞数均随培养天数的增加而减少，以15天时最少。给予脑力智宝后细胞内的脂褐素生成减少，3g/kg的脑力智宝含药血清可明显地抑制脂褐素生成，其抑制率为64.2％。统计学结果具有显著性差异。结果见Tab.3-3.3-4.3-5.

讨 论
自从Hayflick和Moorhead提出培养的细胞可能存在老化现象以来，培养细胞已广泛用于衰老研究的模型系统。有机体是有多细胞组成的，机体的衰老主要表现在细胞衰老及生理功能的下降，离体细胞衰老的规律有可能在某种意义上表达了机体的衰老规律。体外培养条件下，哺乳动物神经元虽不能再分裂，但仍能存活数月之久，它所表现的进行性脂碣素积累、神经元死亡和突起脱落等退行性改变与在体情况非常相似，是研究脑细胞发育、变性、再生和老化的良好模型（10）。MDA是脂褐素形成过程中的中间产物，MDA升高和SOD活性下降是衰老的重要表现。SOD活力的高低间接反应了细胞清除自由基的能力，而MDA含量的高低又间接反应细胞受自由基攻击程度。D－半乳糖引起的细胞衰老的主要机理是由于O2－等活性氧（ROS）过荷引起的脂质过氧化有关（2）。本研究表明，D－半乳糖组的SOD活性降低，MDA含量升高，提示D－半乳糖代谢过程中确实有ROS(Reactive oxygen species,ROS)过荷现象，以O2－为主的ROS应激引起的抗氧化酶活性降低和过氧化水平增高可能是该模型的原因之一。给予脑力智宝后可明显的抑制MDA的生成，并使SOD活性得到明显的恢复。说明脑力智宝对D－半乳糖引起的拟老细胞具活性得到明显的恢复。说明脑力智宝对D－半乳糖引起的拟老化细胞具有明显的保护作用。尼莫地平虽能提高细胞生存率，但对SOD活性和MDA的含量未见有明显的影响（P<0.05），可能抗衰老作用是通过其它途径如降低老化神经细胞内钙等，因为许多研究表明钙离子参与了细胞老化和死亡过程，钙平衡破坏是细胞老化和死亡的中心环节（13，14）。脂褐素是溶酶体对细胞内结构与功能不健全的亚细胞成分进行自体吞噬后形成的残余物质。在老年人和老龄动物的皮质和海马中的神经细胞内可见大量的脂褐素存在，有研究表明神经元胞浆中脂褐素呈增龄性堆积，严重时可占细胞核周质体积的25％（11），脂褐素的积累将破坏磷脂膜结构，导致线粒体和粗面内质网减少以及空泡形成等亚细胞结构的变化，并使神经元数目减少（12）。因此脂褐素的大量堆积，是代表整个细胞功能下降的一种生物学指标。结构是实验生理功能的基础，因而在行为上必然表现出脑功能衰退。研究表明老年痴呆的一个最主要的病理特征是脑皮层神经细胞大量丧失、死亡，并且过氧化损伤是神经元丧失、死亡的主要原因。我们的研究表明，给予脑力智宝后，可明显延长神经细胞在无血清条件下的生存时间，提高神经细胞的存活率，维持细胞的形态，减少脂褐素的生成，3g/kg的脑力智宝含药血清可明显降低脂褐素的生成，抑制率可达64.2％。表明脑力智宝具有抗神经细胞衰老的作用。这可能与其阻止自由基对细胞损伤有关。在实验过程中我们发现，给予受试血清超过5％以上，无血清培养模型不能建立，此实验再一次证明，不同的实验模型，含药血清的加入量将随之变化。
自由基在衰老过程扮演着重要角色，推测以超氧阴离子自由基为主产生一系列过氧化损害，可能是引起衰老的主要原因，本文的脂褐素，丙二醛含量的升高可能是自由基引起脂质过氧化所致，而SOD活性的降低使机体抗氧化能力降低，加重了自由基的损伤作用。这些结果与自然老化表现相吻合，也进一步证实了自由基的致衰老作用。并提示环境的剧烈变化可以改变细胞的老化过程，不良的生存环境可以加速细胞的老化。